免疫印迹技术适应症与禁忌
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正常指标：
无特殊显色反应。
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异常指标：
有特殊显色反应，证明有某种蛋白质存在。
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检查分析：
(1) 蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。 (2) 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。 (3) 转移：(半干式转移) ① 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。 ② 膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。 ③ 转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。 (4) 免疫反应： ① 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。 ② 加入包被液，平稳摇动，室温2hr。 ③ 弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。 ④ 加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。 ⑤ 弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。 ⑥ 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。 ⑦ 弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。 8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
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适宜人群：
检查某种蛋白。
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不适宜人群：
无。
